Mikroskopische Diagnostik: Der Blick auf die Zelle

Gut- oder bösartig? Das ist eine der zentralen Fragen, wenn es darum geht, eine verdächtige Geschwulst abzuklären. Dies ist jedoch fast nie mit dem bloßen Auge möglich: Nur anhand einer aufgearbeiteten Gewebeprobe, die von einem erfahrenen Spezialisten unter dem Mikroskop begutachtet wird, kann die Diagnose "Krebs" gesichert und die Behandlung einer Krebserkrankung effizient geplant werden.

Welche Informationen mikroskopische Untersuchungen in der Krebsdiagnostik liefern, welche Methoden dabei angewendet werden und wie die Molekularbiologie heute die Mikroskopie ergänzt, hat der Krebsinformationsdienst im folgenden Text zusammengestellt.

Welches Ziel haben mikroskopische Untersuchungen?

Was hinter einer auffälligen Gewebeveränderung tatsächlich steckt, kann der Arzt meist nicht allein durch eine körperliche Untersuchung oder Röntgenaufnahmen klären. Um Informationen über die Eigenschaften einer Geschwulst zu erhalten, muss ein Spezialist die bei einem Abstrich, einer Biopsie oder einer Operation entnommene Gewebezellen einzeln oder auch im Verbund als Gewebe genauestens unter dem Mikroskop analysieren.

Ziel dieser mikroskopischen Untersuchungen ist es, mehr über die Beschaffenheit der Zelle und ihrer Bausteine zu erfahren, da diese das Verhalten der Zelle bestimmen: So besitzen zum Beispiel gesunde Zellen auf ihrer Oberfläche Moleküle, über die sie im Gewebe mit ihren Nachbarzellen verbunden sind. Gehen diese verloren, lösen sich die Zellen aus dem Verband und siedeln sich möglicherweise an einem anderen Ort im Körper an, sie "metastasieren". Auch kann ein krankhafter Überschuss eines bestimmten Zelleiweißes dazu führen, dass sich die betroffene Zelle unkontrolliert vermehrt oder nicht mehr abstirbt, wenn sie das Signal zum programmierten Zelltod erhält.  Das Aussehen und das Zahlenverhältnis roter und weißer Blutkörperchen in einer Blutprobe können, unter dem Mikroskop betrachtet, einen ersten Hinweis auf eine Leukämie oder ein Lymphom geben.

Mit Hilfe bestimmter Techniken können die verschiedenen Bestandteile einer Zelle gezielt markiert und anschließend mikroskopisch begutachtet werden. Heute schließen sich an die eigentliche mikroskopische Untersuchung häufig auch Tests mit molekularbiologischen Verfahren an. Gemeinsam können diese Untersuchungen wichtige Informationen über den Tumor preisgeben; der Arzt kann so eine Behandlung gezielter planen oder auch die Wirkung einer Behandlung kontrollieren.  

Blut- und Knochenmarkuntersuchungen nicht nur bei Krebsverdacht

Nicht nur bei Krebsverdacht oder Kontrolle während und nach einer Behandlung werden mikroskopische Untersuchungen durchgeführt. So können Blutuntersuchungen Auskunft über den Allgemeinzustand des Patienten sowie über die Funktionen einzelner Organe, wie Nieren und Leber, geben. Anhand von Knochenmarkuntersuchungen können bestimmte Formen der Blutarmut (Anämie) erkannt werden, die mit einer Krebserkrankung nichts zu tun haben. Einfache Zählungen von Zellen, vor allem bei Blutuntersuchungen, werden heute in fast allen Praxen nicht mehr von Hand unter dem Mikroskop vorgenommen: Die Auswertung geschieht fast überwiegend in Zellzählautomaten, meist mittels der so genannten Durchflusszytometrie.

Wer führt mikroskopische Untersuchungen durch?

Einfachere mikroskopische Untersuchungen wie zum Beispiel die Beurteilung eines Blutbildes können die meisten Arztpraxen durchführen. Untersuchungen, die eine große Erfahrung in der Krebsdiagnostik voraussetzen, bleiben in der Regel aber Spezialpraxen und –labors oder den entsprechenden Fachabteilungen von Krankenhäusern vorbehalten. Dort arbeiten meist Fachärzte für Pathologie oder Neuropathologie mit Zytologieassistenten und medizinisch-technische Assistenten (MTA) zusammen. In schwierig zu diagnostizierenden Fällen kann die Probe auch an ein so genanntes Referenzlabor geschickt werden, das über eine hohe Qualifikation auf einem bestimmten Fachgebiet verfügt, beispielsweise bei der Diagnostik maligner Lymphome. Ist der Befund nicht eindeutig, kann auch ein zweites Referenzlabor um eine Begutachtung gebeten werden.

Zytologie und Histologie: Worin liegt der Unterschied?

Je nach Organ und Fragestellung kann Gewebe "histologisch" oder "zytologisch" untersucht werden. So beschreibt die Histologie die Untersuchung eines zusammenhängenden Gewebeverbandes, wie er beispielsweise durch eine Stanz- oder eine Exzisionsbiopsie gewonnen wird. Der Pathologen kann so Gewebe in Bezug zu benachbarten Strukturen beurteilen und zum Beispiel feststellen, wie tief ein Tumor in die Umgebung eingewachsen ist. Auch der Einbruch von Tumorzellen in Blut- oder Lymphgefäße und damit die Verbreitung von Tochtergeschwülsten (Metastasen) im gesamten Körper wird auf diese Weise abgeklärt.

Bei der Zytologie werden dagegen nur Einzelzellen wie zum Beispiel Blutzellen, Zellen in anderen Körperflüssigkeiten oder Knochenmark, abgestrichene Schleimhautzellen oder kleinere Gewebeteilchen begutachtet. Einzelne Zellen gewinnt man auch aus einem festen Gewebeverband beispielsweise bei der Feinnadelbiopsie von Brust, Prostata oder Schilddrüse oder beim Zellabstrich des Gebärmutterhalses. Zwar erhält man durch die Zytologie keine Informationen zum Gesamtaufbau des Gewebes. Dennoch können Veränderungen der Größe von Zellen oder deren Zellkerne wichtige Erkenntnisse zum Beispiel im Rahmen der Früherkennungsuntersuchung des Gebärmutterhalskrebses liefern (Pap-Test).

Welche Informationen liefern die Untersuchungen?

Tumortyp (Typing): Karzinom, Sarkom, malignes Lymphom oder Leukämie?

Mit Hilfe von histologischen Untersuchungen kann das Ausgangsgewebe eines Tumors ermittelt werden. Zu diesem Zweck vergleicht der Pathologe krankes mit gesundem Gewebe, um Ähnlichkeiten oder Unterschiede im Zelltyp oder der Struktur zu erkennen. Als eine wertvolle Hilfe hat sich dabei die so genannte Immunhistochemie erwiesen: Mit diesem molekularbiologischen Verfahren werden Gewebebestandteile markiert und so unter dem Mikroskop sichtbar gemacht.  Da jedes Gewebe typische Markereiweiße enthält, können diese in einer Tumorprobe, je nachdem ob sie vorhanden sind oder nicht, Hinweise auf den Ursprung des Tumors geben können.

Karzinom, Sarkom, malignes Lymphom, Leukämie

Entspringt der Tumor aus einem so genannten Epithel, das sind Zellen, die als Deck- und Drüsengewebe alle inneren und äußeren Körperflächen bedecken, so sprechen Fachleute von einem Karzinom. Die so genannten Sarkome entwickeln sich dagegen aus Stütz- oder Weichteilgewebe, wie beispielsweise Knochen, Binde-, Muskel- oder Fettgewebe. Zeigen sich unter dem Mikroskop veränderte Blutkörperchen aus einer Probe von Blut oder Knochenmark, handelt es sich möglicherweise um eine Leukämie; finden sich Ansammlungen von veränderten Blutzellen in geschwollenen Lymphknoten oder anderen lymphatischen Organen und im Knochenmark, so liegt der Verdacht auf ein Lymphom nahe.

In manchen Fällen weist Tumorgewebe mehrere verschiedene Strukturen auf. In diesem Fall ist eine einzelne, kleine Gewebeprobe für die genaue Zuordnung der Geschwulst nicht ausreichend. Möglicherweise muss die Gewebeentnahme in diesem Fall wiederholt werden, falls nicht schon während der ersten Biopsie mehrere Proben entnommen wurden.

Differenzierung (Grading): Gut- oder bösartig?

Ein gutartiger (benigner) Tumor erfordert in der Regel eine andere Behandlung als ein bösartiger (maligner) Tumor, der unbehandelt irgendwann Gewebegrenzen überschreitet und möglicherweise Tochtergeschwülste bildet. Ob eine Geschwulst gut- oder bösartig ist,  wird anhand verschiedener Kriterien geklärt. Dafür sind sowohl zytologische als auch histologische Untersuchungen notwendig.

Die Zytologie ist neben der Histologie ein wichtiges Werkzeug, um festzustellen, ob eine Gewebeveränderung gut -(benigne) oder bösartig (maligne) ist. So kann zum Beispiel unter dem Mikroskop beurteilt werden, inwieweit verdächtige Zellen noch gesunden Zellen ähneln. Als Kriterium dient der so genannte Differenzierungs- oder Reifegrad, fachsprachlich auch als "Grading" bezeichnet und meist in Stadien von G1 bis G4 eingeteilt: So sind einzelne gutartige Tumorzellen von normalen, reifen Zellen des Ursprungsgewebes kaum zu unterscheiden; sie besitzen einen hohen Differenzierungsgrad und gelten als weniger aggressiv. Je geringer dagegen eine Tumorzelle ausdifferenziert ist, umso höher ist ihre Malignität (Bösartigkeit). Im Extremfall ist gar keine Ähnlichkeit mehr mit dem Normalgewebe vorhanden. Schlecht differenzierte Tumoren können beispielsweise durch schnelles Wachstum (Proliferation) gekennzeichnet sein.

Um vorhandene Unterscheidungsmerkmale zu untersuchen, werden die Zellen mit einem speziellen  Farbstoff gefärbt. Dieser reagiert chemisch oder physikalisch mit bestimmten Teilbereichen der Zelle und hebt diese dadurch farblich hervor: So besitzen bösartige Zellen in der Regel einen vergrößerten Zellkern, der durch eine stärkere Färbung gekennzeichnet ist. Auch sind unterschiedlich große und vielfältig geformte Zellen ein Kennzeichen eines malignen Tumors; normale Zellen aus einem Gewebe sind in der Regel gleich geformt.

Im Verlauf einer Krebsbehandlung ist die genaue Kenntnis der Tumorausdehnung zu jedem Zeitpunkt wichtig: So muss der Arzt vor Beginn der Therapie wissen, ob ein Tumor örtlich begrenzt ist, Gewebegrenzen überschritten hat und/oder sogar und in umliegende Strukturen eingewandert ist. Sind beispielsweise nahe gelegene Lymphknoten oder Blutgefäße vom Tumor befallen, muss das Vorhandensein von Tochtergeschwülsten im Körper (Metastasen) abgeklärt werden, da sich aus dem Gewebeverband gelöste Krebszellen über Blut oder Lymphbahnen ausbreiten können. Manchmal kann die Tumorausdehnung erst während der Entfernung der Geschwulst am "offenen" Körper bestimmt werden. Dann erstellen die Pathologen mit Hilfe der Schnellschnittdiagnostik den Befund einer Gewebeprobe innerhalb weniger Minuten. So kann der Chirurg das Ergebnis für den weiteren Verlauf des Eingriffs mit berücksichtigen.

Nach einer Tumoroperation wird das entnommene Material mikroskopisch untersucht, auch um sicherzugehen, dass sich kein Resttumorgewebe mehr im Körper befindet. Dabei wird vor allem auf den Randsaum des Tumors, den so genannten Resektionsrand, besonderes Augenmerk gelegt: Besteht dieser aus gesunden Zellen, so ist in der Regel – wenn keine weiteren Metastasen mehr vorhanden sind - keine zweite Operation zunächst mehr notwendig. Sollten jedoch  Resttumorzellen an den Rändern mikroskopisch nachzuweisen sein, müssen unter Umständen in einer zweiten Operation verbliebene Tumorreste entfernt werden, um das Risiko eines erneuten Auftretens des Tumors zu verringern.

Bestimmung der Tumorausbreitung (Staging)

Die genaue Bestimmung der Tumorausbreitung im Körper, das "Staging", folgt international gültigen Regeln. Das am weitesten verbreitete Klassifikationssystem ist das so genannte TNM-System. Zusammen mit dem Tumortyp (Typing) und dem Differenzierungsgrad (Grading) bildet das Ausmaß des Tumors die Grundlage für eine geeignete Therapie des Krebspatienten.

Rezeptoren für Hormon- und Wachstumsfaktoren

Das Wachstum bestimmter Organtumoren, wie beispielsweise Brustkrebs, Prostatakrebs oder Krebs des Gebärmutterkörpers, wird durch Hormone gefördert. In diesem Fall befinden sich in den Tumorzellen Empfängerproteine für Hormone, so genannte Hormonrezeptoren. Bindet das Hormon, beispielsweise Östrogen, an die Andockstelle eines solchen Rezeptors, beginnt die Zelle sich zu teilen. Hormonabhängige Tumoren können durch die Gabe von entgegengesetzt wirkenden Hormonen, so genannten Antihormonen, behandelt werden; das Wachstum der Zellen wird so gebremst. Ungefähr drei Viertel aller Patientinnen mit Brustdrüsenkrebs weisen Hormonrezeptoren auf – wenn auch nicht immer für alle möglicherweise beteiligten Hormone. Zu Beginn einer Brustkrebstherapie muss daher festgestellt werden, ob ein Tumor hormonabhängig ist oder nicht. Ist der Befund negativ, wäre eine Antihormontherapie bei der betroffenen Patientin unwirksam. Der Nachweis der Hormonrezeptoren kann indirekt über biochemische Methoden an frischem, nicht aufbereitetem Tumormaterial erfolgen. In den letzten Jahren hat hier aber vor allem die Immunhistochemie an Bedeutung gewonnen: Mit ihrer Hilfe können Proteine "in situ" sichtbar gemacht werden, also in Gewebeschnitten an der richtigen anatomischen Lage.

HER-2-Rezeptoren

Ungefähr ein Viertel bis maximal ein Drittel aller Brusttumoren weist in erhöhter Anzahl so genannte HER-2-Rezeptoren auf. Diese Zelloberflächenproteine sind Andockstellen für Wachstumsfaktoren, die durch ihre Bindung das Wachstum der Zelle anregen. Manche Brusttumoren produzieren deutlich mehr HER-2-Rezeptoren als für ein normales Wachstum nötig wäre; ein Phänomen, das Fachleute als "Überexpression" bezeichnen. Die Zelle wird im Vergleich zu gesunden Zellen verstärkt zur Teilung angeregt. Mit Hilfe eines speziell gegen den Rezeptor gerichteten Antikörpers kann die Bindung der Wachstumsfaktoren blockiert und damit die Teilung der Krebszelle unterdrückt werden.
Dieses Prinzip liegt der Antikörpertherapie zu Grunde, die bei einigen Brusttumoren angewendet wird. Doch längst nicht bei allen Brustkrebspatientinnen ist diese Behandlung sinnvoll: So sprechen nur Tumoren mit einer deutlichen Überproduktion der Rezeptoren auf diese Behandlung an. Vor Beginn einer Therapie muss ein pathologisches Institut oder Labor anhand einer Gewebeprobe daher genau prüfen, ob und in welcher Menge im vorliegenden Tumormaterial Rezeptoren vorliegen. Neben dem Verfahren der Immunhistochemie kommen hier auch molekularbiologische Techniken zum Einsatz.

Pap-Test

Was passiert mit der Gewebeprobe?

Fixierung

Um Gewebematerial dauerhaft haltbar zu machen oder zumindest so zu konservieren, dass es den Transport ins Labor unverändert übersteht, wird dieses sehr oft gleich nach der Entnahme konserviert. Welche Fixierung der Arzt jeweils durchführt, hängt von der Fragestellung und den daraus folgenden Untersuchungen ab. So wird für Paraffinschnitte das Material in Formalin fixiert. Dieser Vorgang kann je nach Präparat zwischen vier bis 24 Stunden dauern. Um Gefrierschnitte beispielsweise für die Schnellschnittdiagnostik oder die Immunhistochemie anzufertigen, wird das Gewebe dagegen sofort bei minus 80 Grad schockgefroren und im gefrorenen Zustand in hauchdünne Scheiben geschnitten. Für viele Untersuchungen, wie beispielsweise in der Zytogenetik, wird vitales, frisches Gewebe benötigt. Dieses wird ebenfalls nach der Entnahme sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei minus 80 Grad gelagert. Abstriche von Zellen (Zytologie), wie von der Schleimhaut des Gebärmutterhalses oder des Magens, werden auf kleine Glasscheiben, so genannte Objektträger, aufgetragen und mit einem speziellen Fixierspray konserviert.

Makroskopische Untersuchungen

Vor der Aufbereitung und Untersuchung wird jedes Präparat nach Ankunft im pathologischen Institut oder Labor genau registriert, um spätere Verwechslungen auszuschließen. Bei der anschließenden makroskopischen Untersuchung werden mit "bloßem Auge" unter anderem Größe, Form und Gewicht der Gewebeprobe bestimmt. Schließlich schneidet man das Material je nach Fragestellung für nachfolgende Untersuchungen zu: Besonderes Augenmerk gilt den Rändern des Präparats, also der Grenze zu vermutlich gesundem Gewebe.

Paraffinschnitte

Anhand von Paraffinschnitten können bestimmte Strukturen eines Gewebes, wie zum Beispiel Zellkern, Zytoplasma, Bindegewebe oder Muskulatur, mit speziellen Farbstoffen sichtbar gemacht werden. Einzelne Proteine, wie beispielsweise Rezeptoren auf der Zelloberfläche, lassen sich auf Paraffinschnitten gezielt mit Hilfe immunhistochemischer Techniken markieren.

Das fixierte Gewebe wird hierfür in ein Paraffinwachsblöckchen eingebettet. Um dies zu ermöglichen, muss die Probe zuerst in einem aufwändigen mehrstündigen Verfahren entwässert werden. Das entwässerte Material wird anschließend in heißem Paraffinwachs getränkt, das bei Abkühlung erstarrt. Das Einbetten in ein Paraffinwachsblöckchen ist notwendig, um das Abhobeln hauchdünner Gewebeschnitte mit einem Spezialmesser (Mikrotom) zu bewerkstelligen. Die fertigen Paraffinschnitte dienen als Grundlage der mikroskopischen Betrachtung des Gewebes. Sie werden schließlich auf Objektträger aufgezogen, mit speziellen Methoden gefärbt und unter dem Mikroskop untersucht.

Intraoperative Schnellschnittdiagnostik

Schnellschnitte dienen dazu, eine Diagnose noch während einer laufenden Operation zu stellen. Das Material wird schockgefroren und im gefrorenen Zustand in hauchdünne Scheiben geschnitten. Die Gefrierschnitte werden gefärbt und beurteilt, der Befund umgehend dem Operateur mitgeteilt. Dieser kann das Ergebnis noch für den weiteren Operationsverlauf mit einbeziehen. So kann anhand von Gefrierschnitten beispielsweise beurteilt  werden, ob eine Veränderung gut oder bösartig ist. Auch kontrolliert der Pathologe, ob der Randsaum des Operationspräparates tumorfrei ist, also das Entfernen des Tumors im Gesunden erfolgt ist. Für andere Situationen ist diese Technik allerdings nicht einzusetzen: Im Gegensatz zu Paraffinschnitten liefert die Schnellschnittdiagnostik keine genaueren Informationen über die Geschwulst. Darüber hinaus leidet das Gewebe durch das Einfrieren und ist auch bei einer nachträglichen Paraffineinbettung nur noch eingeschränkt für mikroskopische Untersuchungen verwertbar.

Immunhistochemie

Um bestimmte Zellstrukturen nachzuweisen, wenden Pathologie-Labors häufig die so genannte Immunhistochemie an. Bei diesem Verfahren nutzt man künstlich hergestellte Antikörper, die eine Bindungsstelle für das fragliche Protein aufweisen und mit einem Farbstoff beladen sind. Bindet der Antikörper an sein Zielprotein, so ist im histologischen Präparat eine Färbung zu erkennen. Gefärbte Stellen lassen auf das Vorhandensein, Anzahl und Lage untersuchter Proteine schließen. Diese Technik kann an Paraffin- oder Gefrierschnitten durchgeführt werden und spielt eine wichtige Rolle beispielsweise beim Nachweis von Hormonrezeptoren in Brusttumorgewebe: Das Ergebnis ist hier entscheidend für die Wahl der Behandlungsmethode.

Wie lange dauert es, bis das Ergebnis vorliegt?

Je nach Umfang der mikroskopischen Untersuchungen kann ein Befund nach wenigen Minuten mit Hilfe der Schnellschnittdiagnostik oder auch erst nach mehreren Tagen vorliegen. So ist beispielsweise die Fixierungsdauer von der Größe des Präparats abhängig und kann daher allein bis zu 24 Stunden in Anspruch nehmen. Wird für die sichere Beurteilung bei einer bestimmten Krebsart ein Referenzlabor beauftragt, so müssen sich Patienten unter Umständen auf längere Wartezeiten einstellen. Dies gilt vor allem bei schwierig zu stellenden Diagnosen, wenn noch ein zweites Referenzlabor zu Rate gezogen werden muss.

Ist eine Zweitbeurteilung durch einen weiteren Spezialisten möglich?

Das Tumorpräparat ist Eigentum des Patienten. Dieser kann sich das Präparat jederzeit aushändigen lassen, um zum Beispiel die Meinung eines zweiten Pathologen einzuholen. Für die Dauer der Lagerung in pathologischen Instituten von frischem oder in Paraffin eingebettetem Tumormaterial gibt es in Deutschland bisher jedoch keine verpflichtenden Vorgaben, so dass älteres Tumormaterial möglicherweise nicht mehr verfügbar ist.

Bereits angefertigte, gefärbte oder anderweitig aufbereitete Schnittpräparate gehören dagegen nicht dem Patienten, sondern sind Eigentum des pathologischen Instituts oder des Labors, das diese angefertigt hat. Für eine Zweitbegutachtung können sie vom Patienten aber dennoch in der Regel angefordert werden. Fertige und konservierte Präparate eignen sich allerdings meist nicht für die Durchführungen neuer Untersuchungen. Gemäß der Aufbewahrungspflicht muss das zuständige pathologische Institut die Schnitte mindestens zehn Jahre lagern.

Besteht der Wunsch nach einer zweiten Beurteilung, so kann der Patient den behandelnden Arzt oder den Pathologen bitten, das diagnostische Material an einen Pathologen seiner Wahl weiterzuleiten. Dieser so genannte Konsiliarpathologe ist nach Begutachtung des Präparats dazu verpflichtet, den Erstbefunder durch einen Arztbrief über das Ergebnis seiner Diagnostik zu informieren. Über große Erfahrung in der Beurteilung von Tumorproben verfügen zum Beispiel die pathologischen Institute von Tumorzentren oder großen Kliniken. Die Kosten für eine Zweitbeurteilung werden in der Regel nicht von den gesetzlichen Krankenkassen übernommen; der Patient muss diese daher selbst tragen.